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农2021欧洲杯体育彩票检测:转基因玉米测试步骤

2018-10-17

转基因玉米测试步骤

  1.模板DNA提取

    称取2g粉样于10mL离心管中,加入5mL CTAB裂解液(含适量RNA酶),混匀60℃水浴振荡保温1h;2000r/min离心5min;取上清液,加等体积三氯甲烷一异戊醇(24:1)混匀,静置5min,8000r/min离心5min;小心取离心上清液,再加等体积三氯甲烷一异戊醇 (24:1)混匀,静置5min,8000r/min离心5min;取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇。 混匀,12000r/min 4℃离心5min;弃上清液,加500μL 70%冰乙醇洗涤一次,12000r/min4℃离心5min;弃上清液,将沉淀晾干,加入50μL TE,溶解沉淀(4℃过夜,或37℃保温1h);此即为总DNA提取液。也可用相应的市售DNA提取试剂盒提取DNA。

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    2.PCR定性检测

    (1)PCR反应体系。检测转基因玉米中内源基因和外源基因的PCR反应体系。

    每个反应体系应设置两个平行反应。以转基因玉米或已知相应阳性质粒作为阳性对照,非转基因玉米作为阴性对照,以水代替模板DNA作为空白对照。

    (2)PCR反应循环参数  94℃预变性2min,94℃变性40s,55~58℃退火60s(具体退火温度详见11-10),72℃延伸60s,35个循环。72℃延伸5min。4℃保存。也可根据不同的基因扩增仪对PCR反应循环参数做适当调整。

    (3)PCR扩增产物电泳检测。用电泳缓冲液(1×TBE或TAE)制备2%琼脂糖凝胶(其中在55~60℃加入EB或其他染色剂至终浓度为0.5μg/μL,也可在电泳后进行染色)。将10~15μL PCR扩增产物分别和2μL上样缓冲液混合,进行点样。氨基酸检测机构用100bp梯带DNA标记物(Ladder DNA Marker)或相应合适的DNA标记物(DNA Marker)作分子量标记。3~5V/cm恒压,电泳20~40min。凝胶成像仪观察并分析记录。

如何测试玉米转基因——亿信氨基酸检测机构

    (4)结果判断

    ①内源基因的检测用针对玉米内源的IVR基因(或Zein基因)设计的引物对玉米DNA提取液进行PCR测试,阴性对照、阳性对照和待测样品均应被扩增出226bp(或173bp)的PCR产物。如未见有该PCR产物扩增,则说明DNA提取质量有问题,或DNA提取液中有抑制PCR反应的因子存在,应重新提取DNA,直到扩增出该PCR产物。

    ②外源基因的检测对玉米样品DNA提取液进行外源基因的PCR测试,如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带,阳性对照和待测样品均出现预期大小的扩增条带扩增片段长度,则可初步判定待测样品中含有可疑的该外源基因,应进一步进行确证试验,依据确证试验的结果做报告;如果待测样品中未出现PCR扩增产物,则可断定待测样品中不含有该外源基因。

    ③氨基酸检测机构筛选检测和鉴定检测的选择,对玉米样品中转基因成分的检测,可先筛选检测CaMV35S、NOS、NPT、PAT、BAR基因,筛选检测结果阴性则直接报告结果。

    若筛选检测结果阳性,则需进一步鉴定检测IVS2/PAT、Maize genome/CaMV35S、HSP70/CryIAb、CDPK/CrylAb、CaMV 35S/PAT、PAT/CaMV 5S、CaMV 35S/Cry9C、Cry9C/CaMV35S、PactinI/mEPSPS、OTP/mEPSPS基因,以确定是何种转基因玉米品系。

    (5)确证试验样品检测为阳性结果时需要用实时荧光PCR来确证。

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